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血細(xì)胞的離心分離

在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)研究中，常常需要將全血中單核白細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、大單核細(xì)胞）與紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞分離。在臨床治療應(yīng)用中常常需要將全血作成分分離（全血分離成血漿，血小板，白細(xì)胞，紅細(xì)胞等等）

（一）血細(xì)胞的實驗室純化：
血液中存在著各種不同類型的血細(xì)胞，每種類型細(xì)胞有不同的特點和功能。醫(yī)學(xué)研究常常需要較純的單一品種的血細(xì)胞。用離心法分離和純化是非常有效的手段，但如何使血細(xì)胞的密度梯度分離簡單而且實用，很多科學(xué)家和試劑生產(chǎn)廠作了大量的研究和篩選。在這方面Bφyum（文獻1）做了開拓性的研究，他使用挪威Nycomed pharma，A/S公司生產(chǎn)的梯度材料Lymphoprep 和由瑞典Pharmacia-Biosystems AB 公司提供的Ficoll Paque，用簡單的低速階梯梯度離心純化了單核白細(xì)胞獲得成功。此后（文獻2），用非電離性梯度材料Na-metrigoate 和Nycodenz（可消除多糖成分）純化血細(xì)胞效果更好。

典型的離心分離實驗：
1. 人血單核細(xì)胞的純化：
Ⅰ 加有抗凝劑的全血樣品，通常加0.32％檸檬酸鈉較為普遍；
Ⅱ 用等量的等滲鹽液稀釋全血
Ⅲ 在10－15ml離心管下部注入3ml Na-metrizoate-Ficoll分離液
Ⅳ 在分離液上部小心地鋪蓋6ml已經(jīng)稀釋的全血
Ⅴ 低速離心機，水平轉(zhuǎn)頭，單管容量10－15ml，600xg，20分鐘，20℃，慢加速，慢減速。（不要用4－5℃，否則效果很差）
Ⅵ 離心后，單核細(xì)胞和少量血小板懸浮在血液樣品和分離液的中向夾層，小心地用吸管吸出
Ⅶ 在單核細(xì)胞中加幾毫升生理鹽水以降低其密度
Ⅷ 用同樣的離心機250xg，5分鐘，20℃?#27927;?#25968;次，可以得到更純的單核細(xì)胞沉淀
Ⅸ 制備的細(xì)胞可重懸浮在生理鹽水或同源血漿中待用

2. 單核血細(xì)胞和多形核血細(xì)胞的單次離心分離法：
Ⅰ 剛抽出的新鮮人血，加抗凝劑后，取3-5ml鋪在10ml離心管底部
Ⅱ 血樣上部鋪等量的Polymorphoprep（Nycomed Pharma A/S公司產(chǎn)品）
（注意：選擇較細(xì)長透明塑料（PC或PET）離心管或玻璃離心管，液柱總高在6－10mm左右）
Ⅲ 離心：低速或高速冷凍離心機水平轉(zhuǎn)頭450g?5分鐘，20℃
Ⅳ 離心后細(xì)胞分布：以10cm液柱為例，底部1.2－1.4cm為紅細(xì)胞，往上3cm為分離液，再往上0.4cm為中性白細(xì)胞帶（多形核白細(xì)胞），再往上0.6－0.8cm為分離液，在這層分離液和最上層血漿之間夾有一層約0.4cm液柱高的單核細(xì)胞
Ⅴ 如果離心時間過長，或溫度過高，多形核白細(xì)胞（主要是中性白細(xì)胞）也會變成沉淀